Репертуар IGH BCR периферичної крові як біомаркер частих рецидивів нефротичного синдрому у дітей

Методи. 35 дітей із нещодавно діагностованим первинним нефротичним синдромом (PNS), госпіталізованих до афілійованої лікарні Сюйчжоуського медичного університету з вересня 2024 року до вересня 2025 року, розподілили на групу FRNS (n = 20) і групу NFRNS (n = 15), а 15 здорових дітей включили до контрольної групи. За допомогою високопродуктивного секвенування проаналізували особливості використання генів IGH, довжину CDR-H3, соматичну гіпермутацію (SHM) та індекси різноманітності в усіх учасників.

Результати. До лікування глюкокортикоїдами в групі FRNS, порівняно з групою NFRNS, спостерігалися значно вираженіша упередженість у використанні генів IGH, коротша довжина CDR-H3, вищий рівень SHM і нижча різноманітність репертуару BCR (усі p < 0,05). Після лікування ці порушення в групі FRNS зберігалися або ще більше відхилялися від норми, тоді як у групі NFRNS показники поверталися майже до нормальних. Такі фактори до лікування, як нижчий індекс Шеннона, коротша довжина CDR-H3 і вищий рівень SHM, були достовірно пов’язані з меншою ймовірністю ремісії або гіршою клінічною відповіддю у пацієнтів із FRNS після лікування (усі p < 0,01).

Висновок. Особливості репертуару IGH у пацієнтів із FRNS, особливо індекс Шеннона, можуть бути потенційними біомаркерами для ранньої стратифікації ризику та персоналізованого лікування PNS у дітей.

Вступ

Первинний нефротичний синдром (PNS) — одне з найпоширеніших гломерулярних захворювань у дітей. Його основна ознака — масивна протеїнурія, що відображає пошкодження клубочкового фільтраційного бар’єра. У більшості випадків ідеться про хворобу мінімальних змін. Точні причини виникнення цього стану досі не з’ясовані, але нині вважається, що порушення роботи імунної системи сприяє його виникненню, прогресуванню та рецидивам [1].

Глюкокортикоїди (ГК) залишаються стандартним лікуванням першої лінії. Вони спричиняють ремісію у 70–90% дітей під час первинного звернення. Водночас приблизно у половини пацієнтів, які відповідають на лікування, згодом розвивається нефротичний синдром із частими рецидивами (FRNS) [2]. Таким дітям потрібні сильніші імуносупресивні препарати протягом тривалішого часу, що підвищує ризик інфекцій і затримки росту та може погіршувати довгострокову функцію нирок і якість життя [3,4]. Тому для ранньої стратифікації ризику та персоналізованого ведення важливо виявляти імунологічні відмінності між дітьми, у яких розвинеться FRNS, і тими, у кого цього не станеться [5].

Нові дані вказують на важливу роль B-клітин в імунопатології PNS [6,7]. У міру проходження хвороби різних фаз змінюються їхня кількість, склад субпопуляцій, продукція імуноглобулінів і профілі цитокінів [8]. У клінічній практиці ритуксимаб (RTX) — препарат, що виснажує B-клітини, — істотно знижує частоту рецидивів FRNS, що переконливо свідчить про зв’язок поведінки B-клітин з активністю захворювання [9,10]. Однак відповідь на лікування різниться. В одних дітей ремісія зберігається ще довго після відновлення кількості B-клітин, а в інших рецидив виникає навіть за глибокого виснаження B-клітин [11]. Ця неоднорідність свідчить, що одного лише підрахунку B-клітин недостатньо для моніторингу активності хвороби, тому потрібні чутливіші й специфічніші малоінвазивні біомаркери.

Рецептор B-клітин (BCR) — основна молекула, яка дає B-клітинам змогу розпізнавати антигени й запускати адаптивні імунні реакції [12,13]. Репертуар BCR, зокрема його різноманітність, клональний склад, характеристики CDR-H3 і рівні соматичної гіпермутації (SHM), комплексно відображає стан гуморального імунітету та розмноження клонів [14]. Аналіз імунного репертуару BCR на основі високопродуктивного секвенування широко застосовують для з’ясування патогенезу, класифікації підтипів і прогнозування різних імунозалежних захворювань нирок, як-от мембранозна нефропатія та нефропатія IgA [15–17]. Проте систематичні дослідження репертуару BCR у дітей із PNS, особливо пряме порівняння FRNS і нефротичного синдрому без частих рецидивів (NFRNS), а також його змін до та після лікування ГК, досі обмежені [18].

У цьому дослідженні за допомогою високопродуктивного секвенування проаналізовано різноманітність, клональний розподіл, характеристики CDR-H3 і рівні SHM репертуару IGH периферичної крові у дітей із нещодавно діагностованим PNS. Ми прагнули виявити відмінності імунного репертуару до лікування між FRNS і NFRNS, простежити їхню динаміку після терапії ГК та дослідити зв’язок із короткостроковою клінічною відповіддю. Це може допомогти виявити нові біомаркери раннього прогнозування і зрештою сприяти більш цілеспрямованому лікуванню [19].

Методи

Зразки

У дослідження включили 35 дітей із нещодавно діагностованим PNS, госпіталізованих до афілійованої лікарні Сюйчжоуського медичного університету з вересня 2024 року до вересня 2025 року. На підставі відповіді на лікування ГК і частоти рецидивів їх розподілили на групи FRNS (n = 20) і NFRNS (n = 15) [20]. У той самий період до контрольної групи залучили 15 здорових дітей. PNS діагностували відповідно до китайських рекомендацій 2016 року щодо стероїдочутливого нефротичного синдрому з рецидивами або стероїдозалежного нефротичного синдрому [2]. Три групи були зіставними за статтю (χ2 = 0,859, p = 0,593) і віком (F = 0,069, p = 0,874). Дослідження схвалив медичний етичний комітет лікарні (XYFY2025-KL431-01); усі батьки надали письмову інформовану згоду.

Критеріями виключення були: чіткий сімейний анамнез захворювань нирок або спадкова нефропатія; вторинний нефротичний синдром, зокрема вовчаковий нефрит, пурпурозний нефрит, нефрит, асоційований із вірусом гепатиту B, діабетична нефропатія та ураження нирок, спричинене іншими системними захворюваннями; супутні автоімунні захворювання, ендокринні або метаболічні порушення, злоякісні новоутворення, гострі чи хронічні інфекції або інші тяжкі системні захворювання; попереднє застосування імуносупресантів, здатних впливати на імунну функцію, зокрема ГК, імуносупресивних препаратів або біологічних засобів; стероїдорезистентний нефротичний синдром; неповні клінічні дані або неможливість співпрацювати під час спостереження чи збору зразків.

Усі діти з PNS одразу після встановлення діагнозу отримували індукційну терапію ГК: преднізолон призначали перорально у три прийоми в дозі 2 мг/(кг·добу). Після зникнення білка в сечі препарат призначали один раз на добу вранці ще протягом 4 тижнів. Потім пацієнти переходили до етапу консолідації та підтримувальної терапії: преднізолон призначали через ранок у дозі 2 мг/(кг·добу), а через 4 тижні дозу поступово зменшували. Загальна тривалість лікування становила 12 місяців [2].

Повну ремісію визначали як нормалізацію лабораторних показників і зникнення клінічних симптомів. Рецидив визначали за наявності будь-якого з таких критеріїв: зміна білка в сечі з негативного на (+++–++++) у трьох послідовних ранкових зразках сечі; співвідношення білок сечі/креатинін сироватки ≥2,0 мг/мг; або кількість білка в сечі за 24 години (24 h UPQ) ≥50 мг/кг [21]. NFRNS визначали як ≤1 рецидив протягом 6 місяців або ≤3 рецидиви протягом 1 року після первинної повної ремісії, а FRNS — як ≥2 рецидиви протягом 6 місяців або ≥4 рецидиви протягом 1 року після ремісії, індукованої стандартною терапією ГК. Клінічні показники, зокрема 24 h UPQ, альбумін сироватки, креатинін сироватки та азот сечовини в крові, збирали до лікування ГК і після 6 тижнів лікування. Термін оцінювання через 6 тижнів обрали відповідно до китайських рекомендацій 2016 року щодо стероїдочутливого нефротичного синдрому з рецидивами або стероїдозалежного нефротичного синдрому у дітей, які рекомендують початкову індукційну фазу повнодозової терапії глюкокортикоїдами тривалістю 4–6 тижнів [2]. На цей момент клінічну відповідь — повну або часткову ремісію — можна надійно оцінити, і зазвичай ухвалюють рішення про додавання імуносупресивних препаратів. Отже, оцінювання через 6 тижнів дає змогу зафіксувати ранню відповідь на лікування та проаналізувати зв’язок між ранніми змінами імунного репертуару і короткостроковими клінічними наслідками.

Високопродуктивне секвенування бібліотеки генів IGH

На другий день після госпіталізації та після 6 тижнів достатньої терапії ГК у всіх пацієнтів уранці натще брали 4 мл венозної крові. Мононуклеарні клітини периферичної крові (PBMC) відокремлювали центрифугуванням у градієнті щільності Ficoll, обробляли реагентом TRIzol® (Invitrogen, США), лізували та зберігали за температури −80 °C. Загальну РНК екстрагували за допомогою набору для виділення загальної РНК (Omega Bio-tek, США). Використовуючи 1 мкг високоякісної загальної РНК як матрицю, за допомогою випадкових праймерів із шістьма основами та зворотної транскриптази спочатку синтезували кДНК, а потім дволанцюгову кДНК. Фрагменти бібліотеки збагачували методом ПЛР, а продукти ампліфікації очищали електрофоретично за допомогою набору для екстракції з гелю (Axgen, США). Бібліотеку перевіряли на аналізаторі Agilent 2100 Bioanalyzer. Нарешті високопродуктивне секвенування виконували на платформі Illumina NovaSeq 6000 у парному режимі PE. Секвенування проводила компанія Shanghai Baipu Biotechnology Co., Ltd. [22].

Аналіз основних показників імунного репертуару

Клонотип визначали як комбінацію генів IGHV, IGHD, IGHJ і амінокислотної послідовності CDR-H3. Вирівнювання, складання та кількісне визначення генів IGH виконували за допомогою програмного забезпечення MiXCR (версія 4.3.2) щодо еталонної бази даних IMGT (випуск 2024-1). Щоб мінімізувати вплив дублікатів ПЛР і помилок секвенування, клонотипи з частотою менше 0,01% від загальної кількості продуктивних прочитань IGH вилучали. Крім того, для об’єднання послідовностей з однією нуклеотидною відмінністю в ділянці CDR-H3, які мали однакові V/J-гени, у більш поширений клонотип застосовували алгоритм корекції помилок, реалізований у програмі.

Для корекції похибки, спричиненої нерівномірною глибиною секвенування, застосовували стратегію рарефікації. Визначали мінімальну кількість продуктивних прочитань IGH серед усіх зразків — 172 168 прочитань у цьому дослідженні. Для кожного зразка випадково відбирали без повернення таку саму мінімальну кількість прочитань; процедуру повторювали 100 разів, а для зменшення похибки випадкового відбору використовували середні значення. Усі індекси різноманітності, характеристики CDR-H3 і рівні SHM обчислювали на основі рарефікованих даних.

Різноманітність репертуару BCR оцінювали за індексами Шеннона (H′) і Сімпсона (D) [23]. Індекс Шеннона відображає багатство та рівномірність клонів: нижчі значення свідчать про нижчу загальну різноманітність. Індекс Сімпсона відображає перевагу основних клонів: нижчі значення свідчать про значне клональне розширення та нижчу різноманітність бібліотеки. Формула має такий вигляд:

де S — загальна кількість унікальних клональних типів у зразку, а pi — частка i-го клонального типу щодо загальної кількості валідних прочитань секвенування репертуару BCR.

SHM дає змогу оцінити дозрівання спорідненості BCR під тиском антигенного відбору. Що вищим є цей показник, то сильнішим є клональний відбір, зумовлений антигеном. Його обчислювали як співвідношення загальної кількості точкових мутацій до загальної кількості нуклеотидів у цільовій ділянці. Формула має такий вигляд:

Статистичний аналіз

Дані для нормально розподілених безперервних змінних подано як середнє ± стандартне відхилення, а для змінних із ненормальним розподілом — як медіану. Для міжгрупових порівнянь застосовували t-критерій для незалежних вибірок, U-критерій Манна—Вітні або H-критерій Краскела—Волліса залежно від ситуації. Категоріальні змінні аналізували за допомогою χ2 або точного критерію Фішера. Для парних порівнянь до та після лікування використовували парний t-критерій або критерій знакових рангів Вілкоксона. Кореляції між характеристиками репертуару BCR і клінічними параметрами оцінювали за ранговою кореляцією Спірмена. Двобічне значення p < 0,05 вважали статистично значущим. Для міжгрупових порівнянь диференційно експресованих генів IGH контроль частоти хибних відкриттів (FDR) здійснювали методом Бенджаміні—Хохберга; статистично значущим вважали FDR < 0,05. Усі аналізи проводили за допомогою SPSS 26.0 і R 4.5.2 [24].

Результати

Загальні клінічні характеристики дітей

До лікування ГК показники 24 h UPQ і рівні альбуміну сироватки в групах FRNS і NFRNS були значно нижчими, ніж у контрольній групі здорових дітей (HC) (обидва p < 0,05), без істотної різниці між групами. Значущих відмінностей за рівнями креатиніну сироватки та сечовини в крові між трьома групами не було (p > 0,05). Усі пацієнти були чутливими до ГК, але відповідь на лікування через 6 тижнів різнилася (таблиця 1, рисунок 1). Понад 90% пацієнтів із NFRNS досягли повної ремісії; показники 24-h UPQ (0,08 ± 0,05 г/24 год) і альбуміну сироватки (38,2 ± 3,8 г/л) повернулися до норми, а креатинін сироватки та сечовина крові залишалися в межах нормальних значень. Натомість повної ремісії досягли лише 30–40% пацієнтів із FRNS: їхній 24-h UPQ (0,25 ± 0,15 г/24 год) і рівень альбуміну сироватки (32,5 ± 4,5 г/л) були значно нижчими, ніж у групі NFRNS, а креатинін сироватки та сечовина крові — значно вищими (p < 0,01), що свідчить про тяжче ураження нирок [25].

Походження та характеристики експресії генів IGH

Ми провели високопродуктивне секвенування генів IGH у 50 зразках дітей із груп HC, FRNS і NFRNS та виявили загалом 86 генів IGHV, 25 генів IGHD і 10 генів IGHC. Порівняно з групою HC у дітей із PNS, зокрема у групах FRNS і NFRNS, змінювалася частота використання генів IGH. На тепловій карті диференційної експресії (рисунок 2) показано 77 диференційно експресованих транскриптів IGH у дітей із PNS порівняно з HC: 59 мали підвищену експресію, а 18 — знижену. Також профілі експресії генів IGH відрізнялися між групами FRNS і NFRNS: у групі FRNS дев’ять генів мали підвищену експресію, а п’ять — знижену. Примітно, що гени IGHV3-33, IGHV3-48 і IGHV3-66, експресія яких була підвищеною в групі FRNS, у всіх дітей із PNS мали знижену експресію, тоді як гени IGHV4-31, IGHV4-34, IGHV4-49, IGHV4-59 і IGHV7-61, експресія яких була зниженою, у дітей із PNS мали підвищену експресію. Ці відмінності зберігалися до та після лікування ГК, а внутрішньогрупових змін експресії не спостерігали.

Довжина та особливості розподілу CDR-H3

Довжина та розподіл CDR-H3 суттєво відрізнялися між групами (p < 0,001) (таблиця 2, рисунок 3). Середня довжина CDR-H3 у групі HC становила 15,2 ± 1,5 амінокислот, а розподіл був нормальним із піком на рівні 14–16,5 амінокислот. У дітей із PNS CDR-H3 був коротшим (середнє значення 13,5 ± 1,8 амінокислот, p < 0,001), розподіл був вузьким і зміщеним ліворуч із піком на рівні 12–14 амінокислот. До лікування CDR-H3 у групі FRNS був значно коротшим, ніж у групі NFRNS (12,8 ± 1,6 проти 14,1 ± 1,7 амінокислот, p < 0,01); розподіл був вужчим і виразно зміщеним ліворуч. Після 6 тижнів терапії ГК CDR-H3 у групі FRNS став ще коротшим (середнє значення 12,0 ± 1,4 амінокислот, p < 0,01), а його розподіл продовжував зміщуватися ліворуч без покращення. У групі NFRNS показник повернувся майже до рівня HC (15,0 ± 1,6 амінокислот), розподіл став ширшим і повернувся до нормального.

SHM та індекси різноманітності репертуару BCR

Між групами спостерігалися значні відмінності за рівнем SHM (таблиця 2, рисунок 4). У групі HC SHM становила 0,08 ± 0,03, тоді як у групі PNS була значно підвищеною — 0,15 ± 0,05 (p < 0,01). До лікування SHM у групі FRNS була вищою, ніж у групі NFRNS (0,18 ± 0,04 проти 0,12 ± 0,04, p < 0,05). Після 6 тижнів терапії ГК SHM у групі NFRNS знизилася майже до нормального рівня (0,11 ± 0,04), тоді як у групі FRNS продовжила зростати (0,20 ± 0,05), і різниця між групами збільшилася (p < 0,01).

Порівняно з HC різноманітність репертуару BCR (H′, D) у дітей із PNS була значно нижчою (H′: 6,2 ± 1,2 проти 8,5 ± 0,8; D: 0,78 ± 0,08 проти 0,92 ± 0,04; в обох випадках p < 0,001). До лікування H′ (5,5 ± 1,1) і D (0,72 ± 0,07) у групі FRNS були нижчими, ніж у групі NFRNS (відповідно 6,8 ± 1,0 і 0,81 ± 0,06; p < 0,01). Після лікування показники H′ і D у групі NFRNS відновилися, тоді як у групі FRNS ще більше знизилися.

Кореляції між характеристиками репертуару BCR і клінічними наслідками

Аналіз рангової кореляції Спірмена виявив специфічний зв’язок між характеристиками репертуару BCR і клінічними наслідками у групі FRNS, тоді як у групі NFRNS такого значущого зв’язку не спостерігали (усі p > 0,05, рисунок 5). У групі FRNS між H′ до лікування та 24-h UPQ (ρ = −0,72, p < 0,01), а також станом відсутності ремісії (ρ = −0,81, p < 0,001) після лікування виявлено сильну негативну кореляцію. SHM до лікування позитивно корелювала з UPQ за 24 години до лікування (ρ = 0,65, p < 0,01). Довжина CDR-H3 до лікування позитивно корелювала з рівнем альбуміну сироватки після лікування (Φ = 0,58, p < 0,05). Експресія IGHV1-69 корелювала з UPQ через 24 години після лікування (p = 0,51, p < 0,05), тоді як IGHV4-31 корелював із клінічною ремісією (p = −0,56, p < 0,05).

Динамічний аналіз у групі FRNS показав, що ΔH′ негативно корелював із Δ24 h UPQ (ρ = −0,69, p < 0,01) і позитивно — зі зміною рівня альбуміну сироватки (ρ = 0,58, p < 0,05) (рисунок 6). Зміни довжини ΔCDR-H3 (ρ = −0,45, p < 0,05) і ΔD (ρ = −0,51, p < 0,05) негативно корелювали зі зміною Δ24 h UPQ. ΔSHM кореляції не продемонстрував (p = 0,12, p > 0,05). Кореляції між змінами імунних показників і змінами креатиніну сироватки або сечовини крові не виявлено (в обох випадках p > 0,05).

Аналіз ROC-кривої

Як тестову змінну використовували індекс Шеннона до лікування, а як змінну стану — належність до групи FRNS або NFRNS. Аналіз ROC-кривої показав, що індекс Шеннона добре розрізняв FRNS і NFRNS. Площа під кривою (AUC) становила 0,84 (95% ДІ: 0,72–0,96, p < 0,001). Оптимальне порогове значення, визначене за індексом Юдена, становило ≤6,1; чутливість дорівнювала 83,3% (95% ДІ: 67,2–93,6%), а специфічність — 77,6% (95% ДІ: 64,7–87,5%) (рисунок 7).

Обговорення

Це дослідження системно описує характеристики імунного репертуару BCR IGH периферичної крові у дітей із FRNS. Основними є три результати. По-перше, до лікування група FRNS мала істотно інші характеристики імунного репертуару, ніж групи HC і NFRNS: нижчу різноманітність, коротший CDR-H3, вищий рівень SHM та упереджене використання генів IGHV. По-друге, ці порушення в групі FRNS не лише не покращилися після 6 тижнів терапії ГК, а й стали ще виразнішими, тоді як більшість показників у групі NFRNS повернулася майже до нормальних значень. По-третє, індекс Шеннона до лікування був тісно пов’язаний із короткостроковими клінічними наслідками FRNS, що свідчить про його можливу роль раннього прогностичного біомаркера [26].

Безперервне зниження різноманітності репертуару BCR, тобто індексів Шеннона та Сімпсона, у дітей із FRNS свідчить, що за тривалої антигенної стимуляції або патологічних автоімунних реакцій імунна система може зазнавати патологічного олігоклонального розширення. Це, своєю чергою, може призводити до порушення утворення та залучення нових лімфоцитів і зниження здатності до імунної відповіді [27], що вказує на стан імунного виснаження [13]. Крім того, у дітей із FRNS ділянка CDR-H3 була значно коротшою. Аномальне укорочення CDR-H3, який є основною функціональною ділянкою розпізнавання антигенів BCR [28], часто вважають типовою ознакою недостатньої здатності до відновлення запасу B-клітин, зниження імунної функції або імунного старіння [29]. Примітно, що лікування ГК не усунуло тенденцію до виснаження в групі FRNS, але відновило різноманітність у групі NFRNS, що підкреслює істотні імунологічні відмінності між цими двома клінічними фенотипами.

Стійке підвищення SHM до та після лікування у дітей із FRNS свідчить про наявність тривалого процесу дозрівання спорідненості, зумовленого антигеном [30]. SHM зазвичай відбувається в гермінативному центрі, залежить від допомоги T-клітин і є маркером стимуляції B-клітин антигеном [31,32]. Подальше зростання SHM після гормональної терапії може вказувати на наявність довгоживучих B-клітин пам’яті або плазматичних клітин, відносно нечутливих до індукованого стероїдами апоптозу, які можуть тривалий час залишатися активованими [33]. За неспецифічних стимулів, таких як інфекція або втома, ці клітини можуть реактивуватися, секретувати значну кількість патогенних антитіл і порушувати клубочковий фільтраційний бар’єр, сприяючи рецидиву захворювання [34]. Це пояснення узгоджується з клінічною ефективністю RTX, який завдяки вибірковому очищенню CD20+ B-клітин, зокрема згаданих B-клітин пам’яті з патогенним потенціалом, може глибоко впливати на патогенез захворювання [11,35]. Тому пацієнти з FRNS, нечутливі до терапії ГК, яка лише пригнічує активацію B-клітин і спричиняє тимчасовий апоптоз, можуть отримувати користь від терапії RTX [36,37].

У пацієнтів із FRNS спостерігається значна специфіка частоти використання генів IGHV; диференційно експресовані гени, зокрема IGHV1-69 та IGHV4-31, тісно пов’язані з відповіддю на лікування. Це упереджене використання генів IGHV навряд чи є випадковим і може бути наслідком переважного розширення клонів B-клітин під тиском специфічного антигенного відбору. Хоча попередні дослідження припускали, що ці гени IGHV можуть кодувати патогенні молекули антитіл [38], важливо наголосити: сам аналіз диференційної експресії безпосередньо не доводить патогенності. Описаний профіль генів IGHV дає дослідницькі підказки для вивчення молекулярної етіології FRNS, але ці результати мають характер гіпотез. Антигенна специфічність і патогенна роль кодованих антитіл потребують подальшої перевірки за допомогою додаткових експериментів, наприклад одноклітинного секвенування, експресії рекомбінантних антитіл і аналізів зв’язування з антигеном [39].

З погляду клінічного застосування індекс Шеннона до лікування має потенціал як предиктор несприятливої відповіді на терапію. Він негативно корелює з рівнем білка в сечі за 24 години після лікування та станом клінічної ремісії, а динамічні зміни індексу Шеннона до та після лікування відповідають ступеню клінічної ремісії. Аналіз ROC-кривої додатково підтвердив здатність індексу Шеннона до лікування розрізняти FRNS (AUC = 0,84; за порогового значення 6,1 чутливість і специфічність становили відповідно 83,3% і 77,6%). Ці результати свідчать, що індекс Шеннона може бути допоміжним показником для розмежування FRNS і NFRNS та сприяти ранній стратифікації ризику у дітей із нещодавно діагностованим PNS [40]. Отже, вимірювання характеристик імунного репертуару BCR до лікування може допомогти виявити дітей із PNS із високим ризиком FRNS, надаючи орієнтир для індивідуального моніторингу й планування лікування [41].

Це дослідження має кілька обмежень. По-перше, оскільки воно було одноцентровим і мало обмежений розмір вибірки, результати слід екстраполювати обережно. Період спостереження охоплював лише короткострокову відповідь на лікування і не давав змоги оцінити прогностичну цінність імунних маркерів щодо довгострокових рецидивів і прогнозу функції нирок. Крім того, відновлення імунної системи, спричинене глюкокортикоїдами, може потребувати тривалішого часу, наприклад понад 6 місяців, а це дослідження фіксувало зміни репертуару лише протягом 6 тижнів терапії. Тому оцінити довгострокове відновлення імунітету та його зв’язок із тривалим ризиком рецидиву було неможливо. Також у групі FRNS вихідний рівень білка в сечі за 24 години був дещо вищим, а рівень альбуміну сироватки — нижчим, ніж у групі NFRNS (таблиця 1). Неповна збалансованість початкової тяжкості захворювання могла сприяти деяким виявленим відмінностям характеристик репертуару BCR між групами. Через обмежений розмір вибірки ми не проводили багатофакторний регресійний аналіз для корекції потенційного впливу вихідних клінічних параметрів. Тому не можна повністю виключити, що порушення репертуару BCR у пацієнтів із FRNS частково відображають тяжчий вихідний стан, а не внутрішні імунні зміни, специфічно пов’язані з фенотипом частих рецидивів. Для подальшої перевірки незалежного зв’язку між характеристиками репертуару BCR і FRNS потрібні дослідження з більшими когортами, багатофакторним аналізом або зіставленням за оцінкою схильності.

По-друге, дослідження зосереджене на імунному репертуарі BCR без одночасного аналізу репертуару TCR і профілю цитокінів [42,43]. Взаємодія між T- і B-клітинами при FRNS потребує подальшого вивчення. Щодо виявлених нами генів IGHV, пов’язаних із цим захворюванням, їхній патогенний потенціал залишається припущенням, а не доведеним фактом. Тому диференційну експресію генів IGHV, яку спостерігали в цьому дослідженні, слід розглядати як дослідницький результат, а не як доказ патогенності. Подальші роботи, зокрема одноклітинне секвенування [44], експресія рекомбінантних антитіл і визначення зв’язування, мають допомогти з’ясувати, чи справді ці гени спричиняють процес і на які антигени можуть бути спрямовані. Попри ці обмеження, дослідження вперше комплексно описує зміни репертуару BCR IGH при FRNS і визначає індекс Шеннона як перспективний кандидат у біомаркери для ранньої стратифікації ризику, що потребує подальшої перевірки у великих багатоцентрових когортах.

Загалом ми виявили у дітей із FRNS стійкий набір порушень репертуару BCR — нижчу різноманітність, коротший CDR-H3, вищий рівень SHM та упереджене використання IGHV, — які вже були присутні до лікування. Ці характеристики тісно корелювали з короткостроковою клінічною відповіддю, а серед них індекс Шеннона виявився найперспективнішим раннім показником. Наші результати поглиблюють уявлення про імунопатологію FRNS і надають початкові докази того, що аналіз репертуару може допомогти у стратифікації ризику та індивідуалізованому веденні дітей із PNS.

Висновок

У дітей із FRNS до лікування спостерігаються характерні зміни імунного репертуару BCR: зниження різноманітності, укорочення CDR-H3, підвищення SHM та упереджене використання генів IGHV. Ці порушення зберігаються після гормональної терапії та пов’язані з несприятливою короткостроковою відповіддю на лікування. Серед цих показників індекс Шеннона може бути допоміжним індикатором для розмежування FRNS і NFRNS та ранньої стратифікації ризику. Це дослідження пропонує нові підходи до імунологічного типування та індивідуалізованого ведення PNS у дітей.